Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой процесс контролируемого "молекулярного копирования" ДНК, позволяющий нарабатывать (амплифицировать) сколь угодно большое число интересующих последовательностей ДНК. Процесс амплификации напоминает процесс воспроизведения ДНК, который происходит в клетке перед ее делением, с тем лишь отличием, что копируется не вся хромосома, а лишь маленький ее фрагмент.

Открытие ПЦР (1983-1984 гг, Кэри Б. Мюллис (Kary B. Mullis), Нобелевский лауреат по химии 1993 г.) произвело революцию в молекулярной биологии, и трудно перечислить все разнообразие отраслей фундаментальной науки и практической медицины, в которых используется этот метод в настоящее время. Благодаря ПЦР имеется возможность работать с единичными молекулами ДНК, увеличивая их количество в миллионы раз.

ПЦР-анализ - это многоступенчатый процесс. На первом этапе проводится температурная денатурация ДНК, в результате которой двухнитевые сегменты разделяются на отдельные цепи. Затем происходит гибридизация однонитевых фрагментов с праймерами - короткими (20 - 25 нуклеотидов) сегментами ДНК. Гибридизация праймеров осуществляется с комплементарными им участками ДНК, располагающимися по флангам интересующей двухнитевой последовательности. Далее происходит достройка "дочерней" полинуклеотидной цепи на ДНК-матрице в пределах, ограниченных праймерами, с помощью фермента ДНК-полимеразы. Каждый из этапов реакции требует оптимального для него температурного режима, и конечно, подбор праймеров для ПЦР осуществляется таким образом, чтобы они связывались именно с теми последовательностями, которые ограничивают анализируемые гипервариабельные локусы (т.е. эти последовательности должны быть заведомо известны).

Принцип ПЦР.

Синим и красным цветом обозначены две нити участка ДНК, который необходимо копировать.

Принцип ПЦР

Амплифицированные STR-фрагменты, аналогично VNTR-фрагментам, фракционируют в геле и визуализируют их, используя различные методы детекции. В последнее время для этих целей принято использовать флуоресцентные метки, возбуждаемые лазерным излучением, поскольку такой метод, хотя он и требует специального оборудования и значительных материальных затрат, является наиболее чувствительным и позволяет проводить исследование в режиме реального времени. Более того, благодаря разноцветным флуоресцентным меткам, имеется возможность анализировать несколько локусов одновременно.

ДНК анализ STR

Несомненно, методы на основе ПЦР имеют ряд преимуществ по сравнению с VNTR-анализом. Во-первых, они позволяют проводить непосредственное измерение длины каждого гипервариабельного STR-локуса. Это дает возможность избежать проблем неопределенности, связанной с действием рестриктаз, при интерпретации результатов. Во-вторых, получить результаты ПЦР-анализа удается обычно в течение 24 часов, что значительно сокращает время исследования. И наконец, ПЦР очень удобна в тех случаях, когда имеется ничтожно малое количество образца.

И все же, нет ничего совершенного, поэтому не стоит забывать об опасности ложного типирования.

Чувствительность ПЦР - это также и слабая ее сторона. В случае образца, загрязненного посторонней ДНК, может быть произведено множество ее копий: процесс амплификации настолько эффективен, что даже нескольких случайных молекул ДНК, попавших в образец, бывает достаточно для того, чтобы прийти к ложным выводам. Артефакты возможны также как результат неправильного подбора условий ПЦР, при амплификации неспецифических (неаллельных) фрагментов и в некоторых других случаях.

Еще одним недостатком определения STR-фрагментов является то, что они, как правило, имеют меньше аллелей, чем VNTR, и распределение частот аллелей в популяции не такое равномерное. Вследствие этого лаборатория, использующая STR анализ, вынуждена исследовать больше локусов для получения того же количества информации относительно подобия генетического профиля двух людей.

Теоретически, самым точным и информативным методом анализа индивидуальных генетических различий является секвенирование ДНК - "побуквенное" прочтение цепи ДНК. Однако секвенирование всего генома требует слишком высоких затрат времени и материальных средств. Альтернативой ему служит секвенирование полиморфных локусов митохондриальной ДНК.

Митохондриальная ДНКМитохондриальная ДНК локализована не в ядре, а в митохондриях - клеточных органеллах, которые содержат свои собственные маленькие геномы - циклические молекулы ДНК из 16 569 пар оснований. Ряд уникальных биологических свойств делают митохондриальную ДНК высокоинформативным, а в некоторых случаях и единственно применимым инструментом судебно-медицинской экспертизы: она обладает быстрым темпом мутирования (следовательно, высокой изменчивостью), большим числом копий в каждой клетке, материнским характером наследования (то есть каждая молекула передается человеку в неизмененном виде от матери). Исследование митохондриальной ДНК осуществлялось, например, при установлении принадлежности знаменитых Екатеринбургских останков к семье Романовых.

Однако все описанное выше, то есть молекулярно-генетический анализ ДНК - лишь один из этапов идентификации, и для вынесения окончательного результата необходим статистический анализ полученных данных, особенно важный при совпадении генотипов преступника и подозреваемого: ведь в этом случае речь идет порой о человеческой жизни.

Независимо от того, какой тип ДНК-тестирования был использован, интерпретация результатов призвана ответить на два вопроса. Во-первых, необходимо определить, соответствует ли профиль ДНК, взятый на месте преступления, образцам, полученным от подозреваемого. Во-вторых, в случае соответствия, необходимо определить его достоверность. Другими словами, нужно выяснить, насколько распространен данный ДНК-"отпечаток" в популяции, то есть насколько вероятна уникальность полученного ДНК-фингерпринта.

Вероятность точности идентификации - это и есть та самая цифра, которая представляется в суде. Ее величина, удовлетворяющая суд, зависит от обстоятельств дела, и обычно она тем выше, чем более суровое наказание грозит обвиняемому. В США, например, существует требование, чтобы обнаруженный ДНК-фингерпринт был уникален в популяции, численность которой на порядок превышает население Земли.

Для вынесения обвинения нужно убедиться в том, что фрагменты, полученные от подозреваемого и с места преступления, мигрируют в геле на одинаковое расстояние. Последующая компьютерная обработка данных должна подтвердить, что различия в уровне миграции статистически недостоверны (это - этап определения соответствия).

Далее следует оценка достоверности соответствия, основанная на принципах популяционной генетики. Очевидное соответствие ДНК подозреваемого и ДНК, полученной на месте преступления, еще не позволяет предъявить ему обвинение: ведь это совпадение может быть случайным, и аналогичный ДНК-профиль может быть присущ другому человеку. С какой вероятностью возможно такое совпадение? Для ответа на этот вопрос исследователь должен знать относительную частоту, с которой исследуемые варианты (аллели) гипервариабельных участков присутствуют в определенной популяции (к которой относится подозреваемый). Однако это не всегда возможно, поэтому во многих случаях приходится опираться на косвенные данные.

Общеизвестно, что формирование популяции не случайно, и люди склонны выбирать себе партнера из той же географической области, этнической группы или имеющего такие же религиозные взгляды, а также в зависимости от его физических и поведенческих особенностей. Все это накладывает свой отпечаток на частоту возникновения аллелей в популяции. Учет этих данных требует сложного статистического анализа, и в мире до сих пор ведутся дебаты о том, какой из методов наиболее полно учитывает все разнообразие популяционно-генетических данных.

В случае отсутствия генетических данных о популяции, к которой относится подозреваемый, используются данные по другим популяциям, которые обрабатываются с помощью специальных коэффициентов пересчета, что, конечно, снижает надежность идентификации. Кроме того, итоговая вероятность зависит от множества других обстоятельств: вовлечение нескольких подозреваемых или содержание в образцах смеси биологического материала от разных лиц значительно усложняет статистический анализ и интерпретацию результатов теста.

Система CODIS.

Желтым цветом обозначено положение локусов STR на хромосомах.

Система CODIS

В мире существует несколько систем с установленным стандартным набором локусов, по которым проводится ДНК-идентификация. В США, например, принята система CODIS, в которую входит 14 STR-локусов. Они находятся на разных хромосомах, и их независимое распределение делает статистический анализ более достоверным. В Европейских странах более распространен набор ENFSI, по которому исследуется 9 локусов. В России часто используют набор фирмы Promega. Также существуют другие локусы, анализ которых проводится по мере необходимости.

Что касается лабораторных ошибок, возможность которых никогда нельзя исключать при проведении анализа, то именно они являются причиной нарастающего скепсиса общественности в отношении ДНК-идентификации. Ошибки могут возникать на каждом из этапов экспертизы - от сбора образцов до вынесения итогового заключения. Совсем несложно перенести ДНК с одного места на другое, смешать пробы и т. д., то есть сфальсифицировать результаты судебного исследования. Причем допущенные ошибки могут быть обращены как во вред, так и в пользу подозреваемого. Так, со скамьи подсудимых был освобожден футболист О. Дж. Симпсон, обвинявшийся в убийстве своей бывшей жены и ее бой-френда. Несмотря на то, что результаты ДНК-анализа указывали на его виновность, грамотно проведенная защита, выявившая ошибки, допущенные в ходе следствия и экспертизы, не позволила суду вынести обвинительный приговор.

И все же результаты применения молекулярно-генетических методов в криминалистике очевидны: во всем мире начинают выпускать на свободу людей, проведших долгие годы в заключении вследствие несправедливого обвинения. Анализ давних дел, по которым подозреваемые в совершении преступления были признаны виновными, проводится регулярно, однако лишь четверть пересмотренных с использованием новых технологий дел заканчивается освобождением осужденного. Но ведь это тоже положительный результат, не так ли? И ДНК-идентификация должна была появиться хотя бы ради этих людей, вновь обретших свободу, которой их незаслуженно лишили.

В начало  Вторая часть статьи